ИССЛЕДОВАНИЕ ЭффЕКТОВ РЕКОМБИНАНТНОГО ЛАКТОфЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА НА ПРОЛИфЕРАЦИЮ И АПОПТОЗ РАКОВЫХ И ИММОРТАЛИЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК

1ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
2РУП «НПЦ НАН Беларуси по животноводству»
Республика Беларусь, 222160, г. Жодино, ул. Фрунзе, 11

Введение

Впервые лактоферрин (ЛФ) был обнаружен в молоке коров. Позже ЛФ был найден в клетках матки, в миелоидных клетках (особенно в гранулоцитах) и клетках мозга [1]. Первоначально ЛФ рассматривался как железосвязывающий белок молока с бактериостатическими свойствами. железо участвует в различных метаболических процессах, и регуляция его концентрации чрезвычайно важна. В частности, аномально высокое содержание железа приводит к повышенной продукции свобод ных радикалов, повреждающих белки и ДНК [2]. Кроме того, избыток железа приводит к активации микробного роста [3].

Существу ют две формы белка ЛФ – железонасыщенная (холо-лактоферрин) и железоненасыщенная (апо-лактоферрин). ЛФ, обладая высоким сродством к железу, связывает избыток ионов этого металла, которые могут находиться в слизистой кишечника, и тем самым противо действовать микробным инфекциям, а также уменьшать повреждения клеток, вызываемые свободными радикалами [4–5].

Начальная экспрессия гена ЛФ в эмбриогенезе млекопитающих отмечается на стадии 2–4 клеток и продолжается до формирования бластоциста, а затем прекращается до созре вания плода, когда данный белок появляется в нейтрофилах крови и эпителиальных клет ках дыхательного и пищеварительного трак тов [6]. Во взрослом организме ген ЛФ экс прессируется в эпителиальных клетках желез внутренней секреции, а белок секретируется в биологические жидкости. Наиболее высока концентрация ЛФ в молозиве и молоке, но в меньших количествах он обнаруживается так же в слюне, слезной жидкости, кишечнике и репродуктивных тканях [7–8].

В опухолевых клетках ген ЛФ не экспрессируется [9–14]. Эти данные позволили вы сказать предположение о возможности противоопухолевой активности ЛФ. Блокировка экспрессии гена ЛФ в раковых клетках может быть связана с эпигенетическим механизмом, определяемым увеличенным метилировани ем цитозина в ГЦ-богатых районах генного промотора [15]. При подкожном введении мышам в дозе 1 мг человеческий ЛФ (в фор ме лишенного железа апо-лактоферрина или насыщенного железом холо-лактоферрина) ингибировал рост перевиваемых опухолей, индуцируемых v-ras-трансформированными фибробластами и метилхолантреном, а также обладал антиметастазной активностью [16]. Коровий ЛФ ингибировал карциногенез кишечника, легких и мочевого пузыря у крыс при пероральном введении на стадии пост инициации [17]. При этом одновременное введение с карциногенами вело к подавлению карциногенеза, возможно, посредством су прессии ферментов фазы I, таких как цитох ром P450 1A2 (CYP1A2), который индуцируется карциногенными гетероциклическими аминами. Кроме того, повышение глутатион S-трансферазы также могло играть роль в пост-инициационной супрессии рака языка. Интрагастральное введение коровьего ЛФ об ладало антиметастазным эффектом у мышей с карциномой 26 (Co 26Lu), причем повышался локальный и системный иммунитет. Клинические испытания выявили, что перорально вводимый коровий ЛФ ингибирует рост аденомных полипов и может уменьшать риск кар циногенеза кишечника у людей [17–18].

Интригующей особенностью биологической активности ЛФ является подтверждаемая рядом данных (in vivo и in vitro) противоположность его эффектов на нормальные и раковые клетки, а именно стимуляция нормальных и подавление раковых клеток. В разработке новых методов профилактики и терапии раз личных заболеваний особое место занимает направление, основанное на использовании регуляторных факторов, вырабатываемых в самих тканях организма. Эти сигнальные молекулы запускают механизмы, препятствующие патологическим изменениям и стимулирующие восстановительные, регенеративные процессы. В этом плане имеются основания полагать, что в организме вырабатываются регуляторные вещества, активизирующие си стему противораковой защиты и даже блокирующие процесс биологического старения. Согласно предложенной О.В. Квиткоразвитийной теории омоложения [19–23], огромные различия в темпе старения, продолжительности жизни видов и скорости развития онкологических заболеваний определяются тем, что более долговечными и онкорезистентными являются организмы с продолжительными периодами физического развития и роста, когда активно продуцируются сигнальные молекулы (в частности, морфогенетические белки), которые наряду с управлением процессами морфогенеза и роста активизируют эпигенетические процессы восстановления физиологически оптимального спектра экспрессии генов [19–23]. Возможность одновременного участия од них и тех же белков в различных процессах подтверждается явлением плейотропии – полифункциональности, т.е. участия одного и того же гена или белка в разных функциях [24]. ЛФ является многофункциональным бел ком, обладающим аффинностью к различным клеточным рецепторам [25–27]. При этом в исследованиях на культурах костных клеток получены данные об участии ЛФ в регуляции морфогенеза и роста костной ткани [28–29], что позволяет считать его одним из морфо генетических факторов. ЛФ синтезируется и накапливается во вторичных гранулах нейтрофилов и присутствует в плазме крови, что обеспечивает его доставку к различным тка ням организма. К положительным эффектам ЛФ при введении в организм относятся подавление микробных инфекций, стимулирование иммунитета, антивоспалительное действие, противоопухолевая активность и ускорение заживления ран. Особый интерес к использованию ЛФ определяется возможностью его получения из та кого доступного источника, как молоко живот ных, в котором он содержится в значительных количествах. При этом уже реализована возможность производства человеческого ЛФ из молока трансгенных животных, в частности коз, что демонстрируется результатами выполнения союзной программы БелРосТрансген [30]. Это открывает перспективу создания вы сокоэффективных и биологически безопасных лекарственных средств и пищевых продуктов на основе ЛФ человека [30].

Материалы и методы

Работа выполнялась на клетках стандартной линии рака легкого А549 и полученной нами иммортализированной линии клеток из эмбриональных фибробластов человека.

Культуры клеток высевали в ростовой среде, включающей среду RPMI (для линии A549) или DMeM (для линий иммортализированных фибробластов человека), 10% эмбриональной сыворотки телят (ЭТС) и антибиотики (пени циллин и стрептомицин).

Для выполнения экспериментов по количественному анализу и компьютерной видеомикроскопии монослойные клеточные культуры трипсинизировали (для отделения от сосуда клетки снимаются 0,25%-ным раствором трипсина), суспендировали с помощью пипетки в ростовой среде, подсчитывали концентрацию клеток в камере Горяева и высевали клетки при низкой плотности (порядка 10 клеток на 1 мм2 ростовой поверхности) в сосуды Карреля со специально изготовленными стеклянными вкладыша ми (рис. 1). Вкладыши имеют размеры 25 × 10 × 1 мм и разделены на квадратные (1 × 1 мм) участки бороздками шириной 0,2 мм и глубиной 0,05 мм. Бороздки препятствуют перемещению клеток из одного квадрата в другой, что обеспечивает удобство анализа роста культуры.

При помощи шприца в сосуд Карреля добавляли CO2 (5% объема сосуда). После добавления СО2 с помощью шприца сосуды Карреля герметически закупоривали резиновыми пробками.  Клетки культивировали в термостате (37 ºС). После распластывания основной части клеток (после 2 дней культивирования) выполняли компьютерное фотографирование клеток на стеклянных вкладышах (по 30 квадратных участков).

Растворы лактоферрина в культуральной среде (10 мг/мл) пропускали через 0,2 μm фильтр и хранили при 4 ºC. Для создания концентрации 1000 мкг/мл из сосуда отбирали 300 мкл среды и вносили 300 мкл концентрата. Соответственно, для создания концентраций 100 и 10 мкг/мл вносили и отбирали 30 и 3 мкл концентрата и среды соответственно, после чего добавляли во флаконы новую порцию углекислого газа и закупоривали флаконы резиновыми пробками. В контрольных сосудах открывали резиновую пробку и вносили новую порцию углекислого газа. В экспериментах с повторным добавлением ЛФ проводили полную смену культуральной среды.

Рис. 1. Стеклянный вкладыш для культивирования
клеток

Через различные интервалы времени выполняли компьютерное фотографирование тех же участков клеточных культур, что и перед добавлением раствора ЛФ (в опытных вариантах) либо воды (в контроле). Фотографирование выбранных участков культур производилось с помощью компьютерного видеокомплекса «Цитомир», изготовленного совместно с НТЦ «Микроскопия» ОАО «Оптоэлектронные системы» ГНПО «Планар» в рамках проекта подпрограммы «Научные приборы» ГКНТ Республики Беларусь.

Результаты и обсуждение

Исследование эффектов рекомбинантного лактоферрина человека на линию рака легкого А549

В первом эксперименте на клетках линии рака легкого А549 после 2, 5 и 8 дней воздействия лактоферрина не было обнаружено достоверных отличий от контроля по количеству клеток (табл. 1). Не было также обнаружено каких-либо качественных изменений. Все культуры достигли высокой плотности клеток, при этом клетки в основном принимали округлую форму.

В следующем эксперименте после 8 дней, прошедших после первого внесения ЛФ, провели смену среды с повторным добавлением лактоферрина в тех же концентрациях. После повторного введения лактоферрина в ряде участков культур количество клеток уменьшалось, а оставшиеся клетки увеличивались в размере и по морфологии отличались от клеток в контроле, приобретая более веретеновидную форму (рис. 2). Но в целом, как видно из табл. 2, не было обнаружено заметного снижения темпов пролиферации раковых клеток в опытных культурах по сравнению с контролем.

Таблица 1

Число клеток линии рака легкого А549 при однократном введении лактоферрина

Молекулярная и прикладная генетика. Том 18, 2014 г.

Рис. 2. Участок клеточной культуры линии рака легкого А549: а) в контроле; б) после двукратного введения
лактоферрина в концентрации 100 мкг/мл

Таблица 2

Число клеток линии рака легкого А549 при двукратном введении лактоферрина

Исследование эффектов рекомбинантного лактоферрина человека на культуру иммортализированной линии фибробластов человека

Так как в предыдущих экспериментах по 1- и 2-кратному введению лактоферрина в культуру линии А549 не удалось выявить заметных эффектов по ингибиции пролиферации раковых клеток, в следующих экспериментах с иммортализированной линией фибробластов человека культуры применяли 3-кратное введение лактоферрина. После клеточного посева в культуральную среду, содержащую лактоферрин, этот белок также вводился в культуры на 12-й и 20-й дни после первого внесения препарата.

В этих экспериментах на поздних сроках культивирования в культурах с концентрациями лактоферрина 100 и 1000 мкг/мл количество клеток резко уменьшилось (табл. 3–4). Ингибирующий эффект возрастал с увеличением концентрации. Во всех культурах с концентрацией лактоферрина 1000 мкг/мл, а также в одной культуре с концентрацией 100 мкг/ мл произошла полная гибель клеток. В остальных культурах с концентрацией 100 мкг/мл наблюдалось резкое уменьшение числа клеток на фоне продолжающегося увеличения числа клеток в вариантах с концентрацией 10 мкг/ мл и контроле.

Таким образом, обнаружено дозозависимое ингибирующее действие рекомбинантного лактоферрина на культуру иммортализированной линии фибробластов человека при продолжительном культивировании клеток после трехкратного введения препарата. Ингибирующий эффект лактоферрина на линию раковых клеток А549 обнаружен не был, что может быть обусловлено недостаточной продолжительностью культивирования клеток в среде, содержащей лактоферин.

По видимому, особенностью действия регуляторного белка лактоферрина на трансформированные клетки является мягкий, растянутый

Таблица 3

Число клеток иммортализированной линии фибробластов человека 
при трехкратном введении лактоферрина

Таблица 4

Число клеток иммортализированной линии фибробластов человека 
при трехкратном введении лактоферрина

во времени ингибирующий эффект. В то же время, в литературных данных сообщается о возможном стимулирующем действии лактоферрина на нормальные клетки. Это свойство выгодно отличало бы противораковые препараты на основе лактоферрина от традиционных химиопрепаратов, действующих достаточно быстро, но обладающих нежелательными побочными эффектами на нормальные клетки. Следовательно, в будущих исследованиях целесообразно изучить влияние лактоферрина на культуру нормальных клеток, а также на смешанную культуру нормальных и раковых клеток. Противораковый эффект данного белка на смешанных культурах может быть особенно выраженным за счет синергии подавления раковых клеток и стимулирования нормальных.

Заключение

Изучено воздействие различных концентраций лактоферрина из молока трансгенных коз на пролиферацию и апоптоз клеток линии рака легкого А549 и иммортализированной клеточной линии эмбриональных фибробластов человека.

В экспериментах по изучению действия лак- тоферрина на клеточную линию рака легкого А549 при одно- и двукратном введении препарата не было обнаружено заметного снижения темпов пролиферации. Тем не менее, в некоторых участках культур на поздних сроках куль- тивирования наблюдалось уменьшение числа клеток, а также изменение клеточной морфологии. Отсутствие значительного ингибирующего эффекта лактоферрина в экспериментах на клетках раковой линии A549 может быть обусловлено недостаточно продолжительным воздействием лактоферрина.

При изучении действия лактоферрина на иммортализированной линии эмбриональных фибробластов человека при трехкратном введении в культуру лактоферрин уменьшал количество клеток на поздних сроках культивирования в концентрациях 100 и 1000 мкг/мл, причем ингибирующий эффект возрастал с концентрацией препарата вплоть до полной гибели клеток.

Анализ литературных данных демонстрирует неоднозначность действия лактоферрина на разные типы клеток, вплоть до противоположных эффектов. Это свидетельствует о перспективности изучения эффектов лактоферрина в направлении поиска благоприятных ингибирующих либо стимулирующих воздействий. Представляется целесообразным исследовать влияние лактоферрина на культуру нормальных клеток, а также на смешанную культуру нормальных и раковых (иммортализированных) клеток. Ожидается, что противораковый эффект данного белка на смешанных культурах может быть особенно выраженным за счет синергии подавления трансформированных и стимулирования нормальных клеток.

Список использованных источников

1. Levay, P.F. Lactoferrin: a general review /P.F. Levay, M. Viljoen // Haematologica. 1995. – Vol. 80. – P. 252–267.
2. Nancy, C. Disorders of Iron Metabolism /C. Nancy, M.D. Andrews // N engl J Med. –1999. – Vol. 341. – P. 1986–1995.
3. Vogel, H.J. Lactoferrin, a bird’s eye view /H.J. Vogel // Biochem Cell Biol. – 2012. –Vol. 90, № 3. – P. 233–244.
4. Sanchez, L. Biological role of lactoferrin /L. Sanchez, M. Calvo, J.H. Brock // Arch. Dis.Child. – 1992. – Vol. 67. – P. 657–661.
5. Baldwin, D.A. the effect of human se-rum transferrin and milk lactoferrin on hydroxyl radical formation from superoxide and hydrogenperoxide / D.A. Baldwin, e.R. Jenny, P. Aisen //J. Biol. Chem. – 1984. – Vol. 259. – P. 13 391–13 394.
6. Restricted spatiotemporal expression oflactoferrin during murine embryonic devel-opment / P.P. Ward [et al.] // endocrinology. –1999. – Vol. 140. – P. 1852–1860.
7. Masson, P.L. An ironbinding protein com-mon to many external secretions / P.L. Mas-son, J.F. Heremans, C. Dive // Clinica ChimicaActa. – 1966. – Vol. 14. – P. 735–739.
8. Levay, P.F. Lactoferrin: a general review/ P.F. Levay, M. Viljoen // Haematologica. –1995. – Vol. 80. – P. 252–267.
9. Isolation of a lactoferrin cDNA clone and itsexpression in human breast cancer / t. Campbell[et al.] // Br. J. Cancer. – 1992. – Vol. 65. – P. 19–26.
10. Polymorphism and altered methylation ofthe lactoferrin gene in normal leukocytes, leuke-mic cells and breast cancer / t.J. Panella [et al.]// Cancer Res. – 1991. – Vol. 51. – P. 3037–3043.
11. Lactoferrin expression in human breastcancer / S. Penco [et al.] // Cancer Biochem. Bio-phys. – 1999. – Vol. 17. – P. 163–178.
12. Methylation and expression of the lacto-ferrin gene in human tissues and cancer cells /C. teng [et al.] // Biometals. – 2004. – Vol.17. –P. 317–323.
13. expression and prognostic value of lacto-ferrin mRNA isoforms in human breast cancer/ M. Benaissa [et al.] // Int. J. Cancer. – 2005. –Vol. 114. – P. 299–306.
14. Siebert, P.D. Identification of an alterna-tive form of human lactoferrin mRNA that isexpressed differentially in normal tissues and tu-mor-derived cell lines / P.D. Siebert, B.C. Huang// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1997. – Vol. 94. –P. 2198–2203.
15. Methylation and expression of the lactoferrin gene in human tissues and cancer cells /C. teng [et al.] // Biometals.– 2004. – Vol. 17,№ 3. – P. 317–323.
16. Human lactoferrin inhibits growth of solidtumors and development of experimental metastases in mice / J. Bezault [et al.] // Cancer Res. –1994. – Vol. 54. – P. 2310–2312.
17. Cancer prevention by bovine lactoferrin andunderlying mechanisms – a review of experimentaland clinical studies / H. tsuda [et al.] // Biochem.Cell Biol. – 2002. – Vol. 80, № 1. – P. 131–136.
18. Cancer prevention by bovine lactoferrin:from animal studies to human trial / H. tsuda[et al.] // Biometals. – 2010. – Vol. 23, № 3. –P. 399–409.
19. Квитко, О.В. Развитийная доминанта как механизм антистарения / О.В. Квитко // Альманах геронтологии и гериатрии. – 2005. –Т. 4. – С. 73–77.
20. Квитко, О.В. Генетика долговечности /О.В. Квитко // Наука и инновации. – 2009. –Т. 8, № 78. – С. 18–20.
21. Kvitko, O. Signalling pathways and rejuvenation: risks and opportunities // 11th ScientificSymposium of LVMH Recherche, 2011, 27th October, London UK. – P. 30–33.